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　　两种主要类型的?-转角 ?-转角常出现在球状蛋白质的表面附近，这里，肽基中间的两个氨基酸残基能与水形成氢键。 β转角相当于半圈3.010 螺旋 I型是II型出现几率的2倍多，I型和II型的关系在于中心肽单位旋转了1800。II型转角总有Gly残基作为第三个残基（C3），否则由于空间位阻不能形成氢键。 Ⅲ型?-转角 类型III的?-转角是在第一个氨基酸残基与第三个氨基酸残基之间形成的一小段310-螺旋。类型III与I几乎没有区别，因为它们的C1?的构象一样，且C2?的构象相差也很小。 多肽链折叠的空间限制 肽键C-N的双键特性限制了肽键的旋转，肽链上重复出现的肽键平面成为肽单位(peptide unit)或肽基(peptide group)。肽链主链上只有?碳原子链接的两个键是单键，可自由旋转。为表示C? 旋转形成的键角，将N-C?的键角标为?， C?-C的键角标为?。当多肽处于完全伸展构象即所有肽基处于同一平面时，?和?为1800，因此?和?可以是-1800和+1800之间的任意值。但由于肽链骨架和氨基酸侧链之间原子的立体干扰会阻止其中很多值的出现。 两个肽平面以一个Cα为中心发生旋转 多肽链的所有可能构象都能用?和?两个构象角（conformational angle)或称二面角（dihedral angle)来描述。 Φ φ phi fai

　　 psi psai 蛋白质的二级结构(secondary?structure)是指多肽链中主链原子的局部空间排布即构象，不涉及侧链部分的构象。?Pauling等人对一些简单的肽及氨基酸的酰胺等进行了X射线年预测了蛋白质的二级结构。 ?和?均为1800，为完全伸展的肽链构象。 ?和?均为零时的构象，由于相邻肽平面的H原子和O原子之间在空间上重叠，此构象实际上并不允许存在。?和?同时旋转1800，则转变为完全伸展的肽链构象(前页)。 拉马钱德兰图Ramachandran plot 印度生物物理学家G. N. Ramachandran，第一个计算出sterically allowed region。他以?角和?角为坐标轴，作出Ramachandran plot，可以精确地从蛋白质的结构里画出除glycine外的所有氨基酸。 阐述蛋白质或肽立体结构中肽键内α碳原子和羰基碳原子间键的旋转度对α碳原子和氮原子间键的旋转度所绘制的图，主要用来指明蛋白质或肽类允许和不允许的构象。 Ramachandran Plot -Ala residue 深蓝域表示在没有立体重叠即完全允许时的构象；中等蓝域表示处于极端限制情况下不利的原子接触时所允许的构象；浅蓝域表示在键角允许有一些可变性的情况下的构象。 图中的不对称性来自L-立体化学的氨基酸残基，其他带有非分支侧链的L-氨基酸残基的结果基本一致。对分支氨基酸如Val, Ile及Thr，允许的区域要比Ala的要小, Gly的区域要大，Pro所允许的区域要受到非常严格的限制 蛋白质的二级结构 Secondary Structure The term secondary structure refers to the local conformation of some part of the polypeptide. The discussion of secondary structure most usefully focuses on common regular folding patterns of the polypeptide backbone. The most prominent are the ? helix and ? conformations. 蛋白质的二级结构 指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。二级结构以一级结构为基础，多为短距离效应。分为：α-螺旋：多肽链主链围绕中心轴呈有规律地螺旋式上升，顺时钟走向，即右手螺旋，每隔3.6个氨基酸残基上升一圈，螺距为0.54 nm。α-螺旋的每个肽键的Ｎ-Ｈ和第四个肽键的羧基氧形成氢键，氢键的方向与螺旋长轴基本平形。 β-折叠：多肽链充分伸展，各肽键平面折叠成锯齿状结构，侧链Ｒ基团交错位于锯齿状结构上下方；它们之间靠链间肽键羧基上的氧和亚氨基上的氢形成氢键维系构象稳定．β-转角：常发生于肽链进行180度回折时的转角上，常有４个氨基酸残基组成，第二个残基常为脯氨酸。无规卷曲：无确定规律性的那段肽链。主要化学键：氢键。 蛋白质二级结构的类型 ?-helix keratin triple helices collagen triple helices ?-sheet ?-turn Random coil Linus Carl Pauling (1901-1994) 1926年，留学Sommerfeld实验室（1年7个月） 1928年，发明杂化轨道， 创立量子化学 1930年，去Laurence Bragg实验室学X-ray衍射 1936年，与Mirsky一起发表蛋白质变性的理论---氢键 1937年，开始搭α-helix的模型，发现5.4A的周期，与 Astbury的Keratin蛋白测定得到的5.1A不符。此后化了约10年的时间测定各种含肽键的小分子的结构，得出肽键的6个原子在同一平面上的结论 1949年，人造丝X-ray数据发表，他看到了5.4A的周期 1950年， α-helix模型发表，次年发表β-sheet模型 1954年，Nobel化学奖 1964年，Nobel和平奖 70年代，提倡Vitamin C治百病 80年代，盐湖城丑闻 ?-螺旋 ?-helix ?螺旋是一种普遍的蛋白质二级结构 ?螺旋是蛋白质中最常见、含量最丰富的二级结构。螺旋中的每个氨基酸残基C?的成对二面角的?和?各自取同一数值，?=-570、?=-480，即形成周期性有规则的构象。多肽的主链可以按右手方向或左手方向盘绕形成右手螺旋或左手螺旋。每周螺旋占3.6个氨基酸残基、沿螺旋轴方向上升0.54 nm、每个氨基酸残基绕轴旋转1000，沿轴上升0.15 nm。?螺旋中氨基酸残基的侧链伸向外侧，相邻螺圈之间形成链内氢键，氢键的取向与中心轴几乎呈平行关系。氢键由肽键上的N-H的氢与其后面（N端）的第四个氨基酸残基上的C=O的氧之间形成。 肽平面的相叠形成α螺旋 （a）右手?螺旋的形成，刚性的肽键平面与螺旋的长轴平行。 （b）右手?螺旋的球-棍模型，显示链内氢键，重复的单位是单个螺旋的重复，3.6个氨基酸残基构成一个螺旋。 从一个末端看到的?螺旋状态，由长轴的上端往下看，显示R基团的位置。球-棍模型用于强调螺旋的排列。因为球不能表现出单个原子的范德华半径，图示的空心螺旋是个假象(见d图模型)。 显示?螺旋内部的原子，它们是紧密接触的。 ?螺旋的物理参数 O----------------------------H --C-[-NH-C?-HR-CO-]n=3-N— N端 C端 这里，n=3表示氢键封闭的环内共包括13（3?3+4）个原子。常用3.613-螺旋（n=3）代表?-螺旋，其中3.6表示每圈螺旋含3.6个氨基酸残基（非整数螺旋），3.6下角的13表示氢键封闭的环内含13个原子。 α- 螺旋的特性（物理参数） 氢键取向与主轴基本平行 右旋，3.6个氨基酸一个周期，螺距0.54 nm 第n个AA(NH)与第n-4个 AA(CO)形成氢键，环内原子数13。 310-螺旋 310-螺旋（n=2）表示该螺旋每圈含3个氨基酸残基（整数螺旋），氢键所封闭的环内含10（3?2+4）个原子。这种螺旋是当成对二面角取?=-490、?=-260时的螺旋构象，只存在于蛋白质构象的 ?-转角（?-turn）中。 Pauling预测的三种螺旋结构 3.010 helix π16 helix 4.4 residues α helix 第 X 个氨基酸的氨基与（X－n）个氨基酸的羧基之间形成氢键 环内原子数N＝3n+1 蛋白质的?-螺旋几乎都是右手螺旋 蛋白质中的?-螺旋几乎都是右手的，右手的比左手的稳定。前提是螺旋都是由L-氨基酸残基组成的，因此右手螺旋和左手螺旋不是对映体。左手螺旋中L-型氨基酸残基侧链的第一个碳原子（C?)过于接近主链上C=O的氧原子，以致结构不舒适，能量较高，构象不稳定。而右手螺旋中，空间位阻较小，较为符合立体化学空间要求，在肽链折叠中容易形成，构象稳定。左手螺旋虽然稀少，但偶尔也有出现。 左旋和右旋的判断 ?-构象 ?-conformation ?-sheet ?-turn ?-构象将多肽链组织成片状结构 ?-构象也称?-折叠、?-结构、?-折叠片，是蛋白质中第二种最常见的二级结构。两条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的-NH和C=O之间形成有规则的氢键，这种构象为?-构象。在?-构象中，所有的肽键都参与链间氢键的交联，氢键与肽链的长轴接近垂直，在肽链的长轴方向上具有重复单位。除作为某些纤维蛋白质的基本构象外，?-构象还普遍存在于球状蛋白质中。?-构象分为两种类型：平行式(parallel)和反平行式(antiparallel)。 （1）是肽链相当伸展的结构，肽链平面之间折叠成锯齿状，相邻肽键平面间呈110°角。氨基酸残基的R侧链伸出在锯齿的上方或下方。（2）依靠两条肽链或一条肽链内的两段肽链间的C＝O与HN形成氢键，使构象稳定。（3）两段肽链可以是平行的，也可以是反平行的。即前者两条链从“N端”到“C端”是同方向的，后者是反方向的。β－片层结构的形式十分多样，正、反平行能相互交替。（4）平行β－片层结构中，两个氨基酸残基的间距为0.65 nm；反平行β－片层结构，则间距为0.7 nm。 β－片层结构的特点 反平行β－片层结构中，两个残基之间的间距为0.7 nm。 平行β－片层结构中，两个残基的间距为0.65 nm。 ?-构象的空间特征 ?-构象中，多肽主链呈锯齿状折叠构象，侧链的C?-C?键几乎垂直于折叠片平面，侧链R基交替分布在片层平面的两侧。 反平行?-构象在纤维轴上的重复周期为7.0 ?，?=-1390、?=+1350。 平行?-构象是6.5 ?, ?=-1190 ?=+1130 纤维状蛋白质中主要为反平行式，球状蛋白质中两种形式几乎同样广泛存在。 蛋白质分子中，肽链经常会出现180°的回折，在这种回折角处的构象就是β－转角(β－turn或β－bend)。β－转角中，第一个氨基酸残基的-C＝O与第四个氨基酸残基的-NH形成氢键，从而使结构稳定。 ?-转角（?-turn) ?-转角也是蛋白质中的常见结构 ?-转角（?-turn）也称回折（reverse turn）、?-弯曲（?-bend）或发夹结构（hairpin structure），是球状蛋白质中发现的另一种二级结构。有三种类型（两种主要），每个类型都有4个氨基酸残基，弯曲处的第一个氨基酸残基的C=O和第四个氨基酸残基的NH之间形成一个4?1氢键，产生一个不很稳定的环形结构，连接?-螺旋或?-构象。Gly及Pro残基常出现在?-转角处，前者因为小和可变，后者因为肽键中Pro的亚氨氮通常是顺式构型。 蛋白质的二级结构 Secondary Structure of Proteins 蛋白质的空间结构 蛋白质分子的多肽链并非呈线形伸展，而是折叠和盘曲构成特有的比较稳定的空间结构。蛋白质的生物学活性和理化性质主要决定于空间结构的完整。仅测定蛋白质分子的氨基酸组成和它们的排列顺序并不能完全了解蛋白质分子的生物学活性和理化性质。例如球状蛋白质（多见于血浆中的白蛋白、球蛋白、血红蛋白和酶等）和纤维状蛋白质（角蛋白、胶原蛋白、肌凝蛋白、纤维蛋白等），前者溶于水，后者不溶于水，此种性质不能仅用蛋白质的一级结构的氨基酸排列顺序来解释。 蛋白质作为生命体的主要组成成分和生命活动的主要执行者，成为生命科学的研究热点，而结构则是蛋白质研究领域中的一个重要环节。以蛋白质为主体的生物大分子的功能主要取决于它们的三维结构、运动及相互作用。只有全面了解相关蛋白质及其复合物、组装体的精细三维结构、运动和相互作用网络，及其在亚细胞、细胞层次上表现出来的生命活动的功能关系，才能最终阐释人类个体发育、生长、衰老和凋亡机理，才能在分子和原子水平上理解神经活动、认知等脑功能表现机理，细胞增殖、分化和凋亡机理，信息传递和作用机理，疾病发生、发展机理等一切生命科学问题。 20世纪50 年代，Anfinsen 提出蛋白质的特定三维结构是由氨基酸排列顺序决定的, 并因此获诺贝尔奖。Max Perutz 在1959 年解开第一个蛋白质三维结构，即血（肌）红蛋白的三维结构时用了整整22 年时间。今天，以核糖体为代表的复杂的蛋白质机器都陆续得到了解析。自20 世纪90 年代以来，已解蛋白结构的数量呈指数增长趋势，现在大约有42 000 个蛋白质的结构已经被解析，并被存入蛋白质结构数据库(Protein Data Bank，PDB)。从当前的发展趋势来看，蛋白质结构研究必将成为整个生命科学领域的前沿和带头学科，仅在蛋白质晶体学领域中就有11名科学家获得过诺贝尔奖，足见其重要性。 蛋白质一级结构是空间结构的基础 一级结构决定二级结构 一级结构决定了二级结构： Chou和Fasman对29种蛋白质的一级结构和二级结构关系进行统计分析，发现： Glu、Met、Ala和Leu残基是α-螺旋最强的生成者， Gly、Pro是α-螺旋最强的破坏者 Gly、Ala、Ser是β折迭最强生成者 Gly、Pro、Asp、Ser是β转角最强生成者， Ile、Val、Leu是β转角最强破坏者。 一级结构决定了三级结构： 如牛胰核糖核酸酶 一级结构决定了四级结构： 如血红蛋白的四级结构，见球状蛋白质。 蛋白质具有唯一的三维结构 一个经典蛋白质的共价骨架含有数百个化学键，由于围绕这些化学键发生的可能的自由旋转，蛋白质分子可能有无限个空间构象。然而每个蛋白质具有一种特定的化学或结构上的功能，表明每一种蛋白质只有一个唯一的三维结构。1920s后期，几种蛋白质被结晶，包括血红蛋白（Mr 64500）和脲酶（Mr 48300），表明多数蛋白质能被结晶，即使非常大的蛋白质也能形成唯一的结构，支持蛋白质结构和功能之间的必然关系。 天然蛋白质（Native Proteins） 蛋白质中原子的空间排列是蛋白质的构象，一个蛋白质的可能构象包括在不打破共价键的前提下的任意的结构状态。如单键旋转可以导致构象的改变。一个蛋白质分子中有数百个单键，理论上存在无数的构象，生理条件下，会呈现一个或几个主要的构象状态。在特定条件下存在的构象通常是热力学上最稳定的构象，具有最低的自由能。处于功能及折叠状态构象的蛋白质被称为天然蛋白质（native proteins）。 蛋白质的构象由弱的作用力维持 蛋白质结构上的稳定性可以定义为维持天然蛋白质构象的趋势或能力。天然蛋白质是稳定的，生理条件下拆开蛋白质折叠及非折叠状态所需要的能量在20-65 kJ/mol。 打破一个单的共价键需要200-460 kJ/mol，而弱的作用力在4-30 kJ/mol。单个共价键对维持蛋白质构象的作用要比单个非共价键作用的要强得多。但由于非共价作用的数量多，非共价作用仍然是维持蛋白质结构的主要作用。通常具有最低自由能的蛋白质构象（最稳定的构象）是最大数量弱相互作用力所维持的那种。 作用力 破坏因子 氢键： α-螺旋，β-折叠 尿素，盐酸胍 （guanidine hydrochloride ） 疏水作用： 形成球蛋白的核心 去垢剂，有机溶剂 Van der Waals力：稳定紧密堆积的基团和原子 离子键：稳定α-螺旋，三、四级结构 酸、碱 二硫键：稳定三、四级结构 还原剂 配位键：与金属离子的结合 螯合剂 EDTA 维持蛋白质空间构象的作用力 H2NC(:NH)NH2 HCl 蛋白质的稳定性不是简单的所有的多种弱作用力构象的自由能的总和。在折叠的多肽链中每一个氢键结合的基团在折叠前与水发生氢键作用，对于一个蛋白质中形成的每一个氢键，相同基团与水之间的氢键（相同的强度）被打破。一个特定的弱作用力对稳定性的净贡献，或者折叠状态和非折叠状态自由能的差异可能趋向于零，这可以解释为什么蛋白质可以形成天然构象。 生理条件下，蛋白质分子氢键和离子键的形成主要是由相同熵效应所驱动的。极性基团与水形成氢键，溶解于水。然而对于每个单位质量(unit mass)氢键的数量，纯水的要比其他液体或溶液的要大。所以即使是最强极性的分子，它的溶解性也是有限度的，因为它们的存在导致了每个单位质量氢键的净减少。 因此极性分子的周围会形成一个结构化了的水的水化层(solvation shell)。尽管在一个大分子内两个极性基团形成的分子间的氢键或离子键作用的自由能主要被消除相同基团与水之间的这种相互作用所抵消，但在分子间相互作用形成时，结构化了的水的释放提供了一个折叠所需要的熵的驱动力。 极性化合物在水中的溶解是熵增加的过程 水分子在非极性化合物周围形成笼型结构，有序性增加，熵减少。热力学不利！ 疏水作用 蛋白质中的疏水基团彼此靠近、聚集以避开水的现象称之疏水相互作用（hydrophobic interaction）。 因为水分子彼此之间的相互作用要比水与其它非极性分子的作用更强烈，非极性侧链避开水聚集被压迫到蛋白质分子内部，而大多数极性侧链在蛋白质表面维持着与水的接触。 疏水相互作用在维持蛋白质构象中起着主要的作用，也是使蛋白质多肽链进行折叠的主要驱动力。 疏水作用对维持蛋白质的构象重要 蛋白质的内部通常是疏水氨基酸侧链紧密包裹的核心。蛋白质内部任何极性的或带电的基团都有一个可以形成氢键或离子作用的配体。一个氢键对于一个天然结构的稳定性几乎没有贡献，但在一个蛋白质的疏水核心内如果存在没有相应配体的氢键作用或带电基团，对蛋白质的构象是绝对不稳定的，热力学上也是不能成立的。蛋白质中基团间氢键的形成是协同的，一个氢键的形成可以促进其他氢键的形成。所有氢键及其他非共价作用对稳定蛋白质的构象的作用仍在讨论，带电相反基团间形成的离子对（盐桥）也是稳定蛋白质天然构象的贡献。 在疏水相互作用下，蛋白质疏水氨基酸折叠在蛋白质内部，而亲水氨基酸残基暴露在外。 范德华力 广义范德华力包括定向效应、诱导效应和分散效应等。 范德华力包括吸引力和斥力两种相互作用，范德华力只有当两个非键合原子之间处于一定距离时才能达到最大。 虽然范德华力相对来说比较弱，但由于范德华力相互作用数量大，并且具有加和性，因此范德华力是一种不可忽视的作用力。 离子键 离子键是带有相反电荷的侧链之间的离子相互作用。 离子化的侧链一般都出现在球蛋白的表面，与水分子形成水化层，对于整个球蛋白的稳定性的贡献是最小的。 荷电的侧链也在蛋白质内部出现，一般与其它基团形成强氢键。 蛋白质高级结构的原则 疏水残基主要被包埋在蛋白质的内部，远离水的作用。极性或带电残基主要存在于蛋白质的表面。 蛋白质分子中的氢键数量被最大化。 不溶性蛋白质或膜中的蛋白质由于它们的作用或环境遵循不同的规则，但弱的作用力对它们的结构仍然是关键的作用。 蛋白质结构研究的方法 蛋白质结构的测定（研究）方法主要包括： X射线晶体学(X-ray crystallography，X-ray) 核磁共振波谱学(nuclear magnetic resonance, NMR) 三维电镜重构(3-dimension electron microscopy reconstitution) 三种方法都可以完整独立地在原子分辨水平上测定（研究）蛋白质的三维结构。 X射线衍射法(X-ray diffraction，XRD) 到目前为止，研究蛋白质高级结构的方法仍然是以X射线衍射法原理是：当X射线投射到蛋白质晶体样品时，蛋白质分子内部结构受到激发，入射线反射波互相叠加产生衍射波，衍射波含有被测蛋白质构造的全部信息，通过摄影即可得一张衍射图(diffraction pattern)，再用电脑进行重组，即可绘出一张电子密度图(electron density map)。从电子密度图可以得到样品的三维分子图象，即分子结构的模型。 核磁共振波谱学(nuclear magnetic resonance, NMR) 1971年Jeener（比利时）提出二维核磁共振的概念，1985年Kurt在此基础上发明了一种新方法，他选择生物大分子中的质子(氢原子核)作为测量对象，连续测定所有相邻的两个质子之间的距离和方位，这些数据经计算机处理后就可形成生物大分子的三维结构图。用此方法他测定了一个蛋白质的三维结构，奠定了NMR作为蛋白质结构研究方法的重要手段，因此获得2002年诺贝尔化学奖。现在NMR已成为生物大分子溶液三维结构研究的主要手段。 NMR 技术在蛋白质- 蛋白质、蛋白质-DNA 等分子间的相互作用方面，具有高分辨率的特点，仅次于X- 射线晶体学技术，可以在溶液中操作，在近似蛋白质生理环境下测定其结构，甚至可以对活细胞中的蛋白质进行分析，获得“活”的蛋白质结构。NMR 技术在分析蛋白质折叠稳定性、运动性和蛋白质复合体中各亚基的相互作用方面具有优势。 NMR缺点是只能测定小蛋白和中等大小的蛋白质分子(MW 30 000 以下)，并且图谱分析工作极为费时，往往需要数月到一年的时间，导致实验周期延长，速度缓慢；另外核磁共振衍射技术的反应是在溶液中进行的，研究对象必须是可溶的蛋白，对不溶蛋白的研究就比较困难；而且样品需要啊等，这些在一定程度上制约了NMR 技术的应用。 三维电镜重构(3-dimension electron microscopy reconstitution) 利用快速冷冻技术对样品进行冷冻固定，然后利用冷冻电镜和低剂量成像技术对样品进行电子成像，利用高灵敏底片进行成像记录，利用高分辨率扫描仪对底片进行数字化，对数字化的图像进行二维图像分析—选点、分类、校正和平均，最后完成样品的三维重构计算。已有两百余种蛋白质通过该方法获得了结构，使得三维电镜重构技术成为继X-ray 和NMR 技术后，蛋白质结构研究的另一种重要方法。 优势在于：(1)可以直接获得分子的形貌信息，即使在较低分辨率下，电子显微学也可给出有意义的结构信息；(2)适于解析那些不适合应用X 射线晶体学和核磁共振技术进行分析的样品，如难以结晶的膜蛋白、大分子复合体等；(3)适于捕捉动态结构变化信息；(4)易同其他技术相结合得到分子复合体的高分辨率的结构信息；(5)电镜图像中包含相位信息，所以在相位确定上要比X 射线晶体学直接和方便。 蛋白质结构的层次 一级结构：氨基酸序列 二级结构：?-螺旋、?-折叠、?-转角、 不规则卷曲 超二级结构 Module 结构域（domain） 三级结构：所有原子空间位置 四级结构：蛋白质多聚体 肽键的特征-肽键是一个刚性的平面结构 In the late 1930s, Linus Pauling and Robert Corey embarked on a series of studies that laid the foundation for our present understanding of protein structure. They began with a careful analysis of the peptide bond. Each peptide bond has some double-bond character due to resonance and cannot rotate. 六个原子（-Cα—CO—NH—Cα-）基本上同处于一个平面，这就是肽键平面。肽链中能够旋转的只有α碳原子所形成的单键，此单键的旋转决定两个肽键平面的位置关系，于是肽键平面成为肽链盘曲折叠的基本单位。? 相邻氨基酸残基的?-碳原子被3个共价键隔开 一般C=N双键(0.128nm) 肽键的C及N周围三个键角之和均为360° * * * *