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　　缺血性脑卒中是因脑血管栓塞或脑供血不足导致的脑组织缺血坏死的疾病。缺血性脑卒中具有发病率高、致残率高、致死率高、复发率高的 “ 四高 ” 特征［ 1-2 ］ 。近年来，缺血性脑卒中患者的数量也在不断增加，在临床中较为常见，对人类的生命安全具有较大威胁，因此，迫切需要更有效的药物治疗这种疾病。中药已有几千年的历史，广泛应用于缺血性脑卒中的临床治疗，具有不良反应少和整体调节等特点。黄芎方（黄芎抗栓胶囊、通脑精胶囊）由大黄、石菖蒲、川芎、郁金中药组成，全方具有活血解毒、行气化痰的功效［ 3 ］ 。黄芎方在临床上主要用于卒中的治疗，包括缺血性脑卒中、腔隙性脑梗死及糖尿病并发脑卒中等［ 4-6 ］ 。临床研究表明，黄芎方能有效抑制炎症因子，改善神经功能缺失，改善缺血缺氧，从而更好地保护大脑［ 7-9 ］ 。然而，黄芎方治疗缺血性脑卒中的作用机制尚不明确。

　　网络药理学结合系统生物学、组学和计算生物学，从整体角度阐明药物作用机制，它具有完整性、协同性和动态性的特点［ 10 ］ 。这些特征与中医整体观相似［ 11 ］ 。该方法为中药的多成分、多靶点治疗提供了新的视角［ 12 ］ 。该方法通过网络映射和分析提供了对药物作用和疾病复杂性的系统理解，网络药理学方法在阐释中药治疗疾病作用机制方面发挥了重要的作用［ 13 ］ 。本研究采用网络药理学、生物信息学和分子对接的方法，对黄芎方治疗缺血性脑卒中可能的作用途径和靶点进行初步预测；在此基础上，构建脑缺血 / 再灌注（ I/R ）大鼠模型，并给予黄芎方治疗，进一步验证黄芎方治疗缺血性脑卒中效果及作用机制，为黄芎方治疗缺血性脑卒中的临床应用提供一定的理论依据。

　　2.1.1黄芎方有效成分及靶点筛选 利用中药系统药理学数据库与分析平台（ TCMSP ， https ：tcmsp.php ）数据库以及中国知网（ CNKI ）、 PubMed 相关文献报道获取黄芎方组方药材石菖蒲、大黄、川芎和郁金的主要活性成分，以口服生物利用度（ OB ） ≥ 30% 和类药性（ DL ） ≥ 0.18 ［14 ］ ，筛选出黄芎方潜在的活性成分。同时通过查阅文献寻找不满足上述筛选条件，但在治疗缺血性脑卒中方面有相关活性的化合物，如 α- 细辛醚、 β- 细辛醚、阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯 A 等，将这些成分一并作为候选成分纳入分析。基于数据库 Swiss Target Predictions （ http ： //），将可能性设置为 Probability ＞ 0 ，提取上述筛选得到的化学成分的潜在作用靶点。

　　2.2.2动物造模及分组 SD 雄性大鼠 ip 戊巴比妥钠麻醉后，仰卧位固定，颈部中线切口。分离左侧的颈总动脉（ CCA ）、颈外动脉（ ECA ）和颈内动脉（ ICA ）。采用无创血管夹，同时夹闭近心端 CCA 及远端 ICA 。于 CCA 用显微剪刀剪一小口，插入制备好的线栓。通过 CCA 分叉，进入 ICA 。调整线栓角度以避免误入翼腭动脉。插入线段直至遇到轻微阻力，深度以过 CCA 分叉 17 ～ 18 mm 为宜。插线结束后，将预先放置于 ECA 的结扎线缚紧，以防止线段滑出和出血。颈部伤口常规缝合。缺血 2 h 后，将线 mm ，即可实现再灌注。假手术组不将线栓插入大脑中动脉。除假手术组外（ n ＝ 21 ），将 69 只 I/R 大鼠随机分为 3 组：模型组、黄芎方（ 3.6 g·kg -1 ，根据前期研究以及文献报道［ 17 ］ 确定此剂量）组、阿司匹林（ 9 mg·kg -1 ）［ 26 ］ 组。 I/R 手术后，黄芎方组和阿司匹林组每日 ig 给药 1 次，连续 7 d 。假手术组和模型组 ig 给予等量生理盐水，持续 7 d 。

　　2.2.5免疫组织化学染色法检测 Iba1 阳性表达 采用免疫组织化学法检测大鼠下丘脑 Iba-1 的表达，取出脑组织适量，石蜡切片， 42 ℃ 烤片 2 h ，再经脱蜡和水化后，枸橼酸钠缓冲溶液高温高压修复。 TBST 洗 3 次，每次 5 min ， 5% BSA 室温封闭 1 h 后，加 1∶200 羊抗 Iba-1 一抗（ 5% BSA 稀释） 4 ℃ 过夜。回收一抗后，切片 TBST 洗 3 次，每次 5 min 。 3% H2O2 覆盖 15 min 后，再 TBST 洗 3 次，每次 5 min 。滴加反应增强液，室温孵育 20 min ， TBST 洗 3 次，每次 5 min 。增强酶标兔抗山羊 IgG 聚合物室温孵育 20 min ， TBST 洗 3 次，每次 5 min 。 DAB 避光显色 15 min ，流水冲洗后擦干，组织脱水透明，中性树胶封片，显微镜拍摄。

　　3.1.1黄芎方活性成分及靶点筛选 通过 TCMSP 数据库以及相关文献检索［ 19-22 ］ ，选择标准参数 OB ≥ 30% 、 DL ≥ 0.18 对主要化学成分进行筛选。通过 Pubchem 数据库获得成分对应的 SMILES 结构，将 SMILES 结构输入到 Swiss Target Prediction 数据库中，将可能性设置为 Probability ＞ 0 ，检索得到有 21 个有效成分，对应潜在靶点 624 个。除上述成分之外，基于文献研究［ 23-25 ］ 有 14 个候选化合物纳入研究，对应的潜在靶点有 392 个。通过 TCMSP 平台无法检索到黄芎方中 3 ， 4 ， 5- 三甲氧基肉桂酸成分，通过查阅文献获取 3 ， 4 ， 5- 三甲氧基肉桂酸进行后续分析［ 19 ］ 。具体成分信息见表 2 。

　　3.1.3交集靶点富集分析结果 将黄芎方治疗缺血性脑卒中的 56 个靶点上传至 DAVID 数据库进行 GO 富集分析和 KEGG 分析。 GO 功能注释分析显示，生物过程（ BP ）主要涉及炎症反应、脂多糖反应和环氧化酶途径等；细胞组分（ CC ）主要涉及分泌颗粒膜、胞外体和质膜等；分子功能（ MF ）主要涉及对蛋白丝氨酸 / 苏氨酸激酶活性、葡萄糖结合和蛋白激酶活性等，均取排名靠前的 10 个条目可视化（图 3-A ）。 KEGG 通路富集，以 P 值排序，对排名前 10 的与缺血性脑卒中相关的信号通路进行可视化（图 3-B ），这些通路包括代谢途径、中性粒细胞胞外诱捕网形成、缺氧诱导因子 -1 （ HIF-1 ）信号传导途径等。

　　3.1.7免疫浸润分析结果 对 GSE16561 进行 ssGSEA 分析，得到了免疫细胞在缺血性脑卒中患者和健康人中的统计差异。 GSE16561 数据集显示中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、浆样树突状细胞、激活树突状细胞、自然杀伤细胞、记忆性 B 细胞、调节性 T 细胞、 2 型辅助性 T 细胞、 γδT 细胞、效应型 CD4 T 细胞、中枢型记忆 CD8 T 细胞的浸润水平在缺血性脑卒中患者中显著增加（图 7-A ）。提取患者免疫细胞相关数据，将缺血性脑卒中患者按照核心基因分析免疫细胞数量差异。结果显示， TLR4 表达与中性粒细胞呈显著正相关，激活 B 细胞呈显著负相关； STAT3 表达与激活树突状细胞呈显著正相关，激活 CD8 T 细胞呈显著负相关； HIF-1A 表达与自然杀伤细胞呈显著正相关； MPO 表达与肥大细胞呈显著正相关，激活 CD4 T 细胞呈最显著负相关； MMP9 表达与肥大细胞呈显著正相关，激活 CD8 T 细胞呈显著负相关（图 7-B ～ F ）。

　　3.2.1黄芎方对 I/R 大鼠的保护作用 如图 8-A 所示，假手术组大鼠未观察到神经行为的缺损，而模型组大鼠的神经行为学评分显著升高，出现显著的神经行为损伤（ P ＜ 0.01 ）。与模型组相比，黄芎方组和阳性药阿司匹林组大鼠的神经行为缺陷程度均明显降低，其可有效减少缺血对局部脑区神经元的损伤（ P ＜ 0.01 ）。采用 TTC 染色从梗死体积方面评价黄芎方对 I/R 大鼠的脑保护作用。各组 TTC 染色脑切片见图 8-B ，梗死体积统计数据见图 8-C 。假手术组大鼠无脑梗死体积，模型组大鼠脑组织出现严重的梗死（ P ＜ 0.01 ），黄芎方组和阿司匹林组可显著降低 I/R 大鼠脑梗死体积（ P ＜ 0.01 ）。

　　本研究利用 TCMSP 数据库（ OB ≥ 30 且 DL ≥ 0.18 ）和文献检索获得 35 种黄芎方活性成分，通过 Swiss Target Prediction 数据库获得对应靶点 754 个。利用 GEO 数据库获取了 677 个缺血性脑卒中相关靶点，通过与黄芎方靶点的交集，获得了 56 个交集靶点。为了进一步明确黄芎方治疗缺血性脑卒中的机制，对交集靶点进行了 GO 和 KEGG 分析， GO 分析表明黄芎方中活性成分可能通过分泌颗粒膜、胞外体和质膜等细胞组分参与炎症反应、脂多糖反应和环氧化酶途径等生物学过程。这些结果提示黄芎方可能作用于多细胞组分产生不同生物学功能，从而发挥治疗缺血性脑卒中的功效。 KEGG 分析表明，代谢途径、中性粒细胞胞外诱捕网形成、 HIF-1 信号传导途径等可能在黄芎方治疗缺血性脑卒中发挥重要作用。

　　基于成分 - 靶点 - 通路网络，发现黄芎方治疗缺血性脑卒中的主要活性成分为 α- 细辛醚、 β- 细辛醚和阿魏酸等。有研究报道 α- 细辛醚在改善缺血性脑卒中诱导的脑损伤中发挥了明显作用，且能减少脑 I/R 引起的脑梗死体积，改善脑神经功能等，其可能机制是下调 IL-1β 、 IL-18 表达［ 30 ］ 。异阿魏酸具有抗炎活性［ 31 ］ 。 β- 细辛醚具有抗炎活性，易透过血脑屏障到达脑组织，为治疗各种脑疾病方面提供了重要保障［ 32 ］ 。阿魏酸具有清除和抑制氧自由基、抗脂质过氧化作用，进而加强脑缺血再灌注损伤的保护作用［ 33-34 ］ ，阿魏酸还具有可明显抑制小胶质细胞活化、神经性炎症的作用［ 35 ］ 。 3 ， 4 ， 5- 三甲氧基肉桂酸对脂多糖诱导的 BV2 小胶质细胞 NO 生成具有显著抑制作用［ 36-37 ］ 。由此推测，黄芎方具有多成分、多靶点的特点，这些活性化合物与缺血性脑卒中的相关性有待深入研究。

　　运用 cytoHubba 插件筛选出黄芎方治疗缺血脑卒中的核心靶点 TLR4 、 STAT3 、 HIF1A 、 MPO 和 MMP9 ，这些靶点基因与缺血性脑卒中关系密切。 TLR4 参与神经系统缺血低氧损伤， TLR4 是 1 种先天性免疫受体家族，在调节炎症和参与脑卒中引起的神经炎症中发挥重要作用，多项研究证实 TLR4 是脑卒中治疗的重要靶点［ 38 ］ 。已有研究表明， STAT3 在小胶质细胞活化过程中发挥重要作用，小胶质细胞活化介导的炎症反应在缺血性脑卒中的发病机制中起重要作用［ 39 ］ 。 MPO 是缺血性脑卒中发生的炎症因素之一，通过与不同的细胞信号分子的复杂相互作用，受多种细胞信号机制所调节［ 40 ］ 。研究发现， HIF1A 显著减轻 I/R 大鼠脑水肿并改善其神经功能［ 41 ］ 。脑缺血后 MMP9 的表达上调，与随后发生的脑损伤密切相关［ 42 ］ 。分子对接结果验证了 α- 细辛醚、 3 ， 4 ， 5- 三甲氧基肉桂酸、 β- 细辛醚、异阿魏酸和阿魏酸与 TLR4 、 STAT3 、 HIF1A 、 MPO 和 MMP9 具有良好的结合能力，说明成分与靶点发生作用的可能性较大。

　　将网络药理预测结果与动物实验相结合，评估黄芎方对缺血性脑卒中的治疗效果，并验证其预测靶点的可靠性。本研究观察了黄芎方对脑 I/R 损伤大鼠的脑保护作用，黄芎方可减少神经行为学评分、梗死体积、活化小胶质细胞向阿米巴样形态转化。 ELISA 结果表明，与模型组相比，黄芎方明显降低模型大鼠脑组织促炎因子 TNF-α 、 IL-1β 及 IL-6 的水平。这些结果表明，黄芎方可以改善脑损伤，与以往的研究一致［ 9 ］ 。进一步验证了黄芎方对脑组织中核心靶点的调节作用，与模型组相比，黄芎方组大鼠脑组织的 TLR4 、 STAT3 、 MPO 、 MMP9 mRNA 表达水平明显降低。同时，与模型组相比，黄芎方组大鼠脑组织的 HIF1A mRNA 的表达明显增加。这些结果表明，黄芎方对缺血性脑卒中的治疗机制与 TLR4 、 STAT3 、 HIF-1A 、 MPO 和 MMP9 的核心靶点有关。