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　　（二）蛋白质的超二级结构和结构域 超二级结构类型 卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域 平行?-折叠的结构比较（a） ?-园桶形排布，（b）马蹄形排布 （三） 蛋白质的三级结构 肌红蛋白三级结构 核糖核酸酶三级结构示意图 （四）蛋白质的四级结构 血红蛋白四级结构 烟草花叶病毒外壳蛋白四级结构的自我组装 二、维持蛋白质分子构象的作用力a.盐键 b.氢键 c.疏水键 d.范得华力 e.二硫键 第四节 蛋白质的分子结构与功能 一、一级结构与功能的关系 细胞色素Ｃ 不同种的细胞色素Ｃ由104－114个氨基酸残基组成，有38氨基酸是各种生物共有的。从图3－17可知：亲缘关系越近，氨基酸差异数越少，其结构越相似。 说明一级结构中氨基酸残基的顺序固然重要，但并不是每个氨基酸残基的位置都不能变。 不同生物与人的Cytc的AA差异数目 不同生物来源的细胞色素c中不变的AA残基 2、血红蛋白分子病 二、蛋白质的构象与功能关系 猪胰岛素原激活成形成胰岛素示意图  2、血红蛋白： 1）结构： 血红蛋白由四个亚基组 成（α2β2） 2）血红蛋白输氧功能和构象变化 3）影响血红蛋白与氧亲和力的因素 H＋和CO2的影响：（Bohr效应） 在生理PH范围内，降低PH可使血红蛋白与氧的亲和力降低；恒定PH条件下，增加二氧化碳的浓度，也能降低血红蛋白与氧的亲和力。 2,3－二磷酸甘油酸的影响 当红细胞中无2,3－二磷酸甘油酸时，血红蛋白与氧的亲和力强；当2,3－二磷酸甘油酸与血红蛋白结合后，极大地降低血红蛋白与氧的亲和力。 血红蛋白与氧结合后，亚铁离子的价数不变，这是血红蛋白的一个重要性质。如果Fe2+氧化成Fe3+血红蛋白与氧结合的部位就被水取代。 3、免疫球蛋白 第五节蛋白质的重要性质 谷胱甘肽 二、蛋白质两性解离性质和等电点 三、蛋白质胶体性质 四、蛋白质的沉淀 2、有机溶剂沉淀（pH＝pI） 降低溶液的介电常数，破坏蛋白质周围的水化膜。有时使蛋白质变性 3、重金属盐类沉淀（pHpI） 重金属离子带正电荷与带负电荷的蛋白质结合形成沉淀。蛋白质变性 4、生物碱试剂和某些酸类沉淀（pHpI） 生物碱试剂和某些酸带负电荷与带正电荷的蛋白质结合成沉淀。蛋白质变性。 5、加热变性沉淀（pH＝pI） 破坏蛋白质的空间结构，使蛋白质变性。 蛋白质变性和沉淀反应是两个不同的概念 变性的蛋白质不一定沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性 五、蛋白质变性与复性 核糖核酸酶变性与复性作用 六、蛋白质的紫外吸收光谱 七、蛋白质主要呈色反应 双缩脲反应 简单蛋白质分类 结合蛋白质分类 问答题和计算题 课堂练习答案 2、简述研究核酸、蛋白质一级结构的意义。 问答题： 1、已知Glu 的α-COOH、 α-NH3+和R基团的pk分别为2.19、 9.67和 4.25 。回答下列问题： 1）写出Glu在PH由强酸性变成强碱性的解离过程 2）在等电点时Glu以何种形式存在 3）计算其等电点 4）PH分别为1、3、5、7、9、12时氨基酸向电场中什么方向移动？ 2、测定1种细菌七肽的氨基酸顺序。经分析，它的氨基酸组成是：Lys1 Pro1 Arg1 Phe1 Ala1 Tyr1 Ser1。经胰凝乳蛋白酶作用前，此肽不与DNFB反应。经胰凝乳蛋白酶作用后，此肽水解为2个肽A和B，A肽的氨基酸组成分别为Ala1 Tyr1 Ser1，B肽为Lys1 Pro1 Arg1 Phe1 。A肽和B肽分别与DNFB反应产生DNP-Ser和DNP-Lys。此七肽与胰蛋白酶反应，同样能生成2个肽，它们的氨基酸组成分别为Pro1 Arg1 和Ala1 Tyr1 Ser1 Lys1 Phe1 。写出该七肽的氨基酸顺序。 3、为什么说蛋白质水溶液是一种稳定的亲水胶体？ 4、、试比较Gly、Pro与其它常见氨基酸结构的异同，它们对多肽链二级结构的形成有何影响？ 5、试举例说明蛋白质结构与功能的关系（包括一级结构、高级结构与功能的关系）。 名词解释 等电点（pI） 肽键和肽链 肽平面 一级结构 二级结构 三级结构 四级结构 超二级结构 结构域 二、分子大小、形状及分子量的测定 分子量 10000－1000000 形状球形椭圆形纤维状 分子量的测定 1、根据化学组成测定最低相对分子质量 例：已知血红蛋白中含铁量为0.34%,计算血红蛋白的最低相对分子质量 55.84(100/0.34)=16700 2、用物理化学方法测定蛋白质的相对分子质量 1）超速离心 2）分子筛层析 3） SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 ● 蛋白质各自所特有的高级结构，是表现其物理性质和化学特性以及生物学功能的基础。当天然蛋白质受到某些物理因素和化学因素的影响，使其分子内部原有的高级构象发生变化时，蛋白质的理化性质和生物学功能都随之改变或丧失，但并未导致其一级结构的变化，这种现象称为变性作用（denaturation）。 表征：生物活性丧失；物理性质（溶解度降低、粘度增大、扩散系数降低、紫外吸收上升等）和化学性质（化学反应，被酶解性）改变 应用：变性灭菌、消毒；变性制食品；抗衰老…… ●蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象成为复性（renaturation）。 Native ribonuclease Denative reduced ribonuclease Native ribonuclease 8 M urea and ?-mercapotoethanol Dialysis 变性 复性 蛋白质在远紫外光区（200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。 蛋白质质量浓度/（mg/ml）=1.55A1cm - 0.76A1cm 280 260 测定范围：0.1～0.5mg/ml 双缩脲反应 酚试剂反应 →蛋白质定量、定性 茚三酮反应 测定常用方法 蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物 红紫色络合物 (硷性溶液) Cu2+ 1、为什麽说蛋白质是生命活动最重要的物质基础？ 2、试比较Gly、Pro与其它常见氨基酸结构的异同，它们对多肽链二级结构的形成有何影响？ 3、试举例说明蛋白质结构与功能的关系（包括一级结构、高级结构与功能的关系）。 4、为什么说蛋白质水溶液是一种稳定的亲水胶体？ 5、什麽是蛋白质的变性？变性的机制是什麽？举例说明蛋白质变性在实践中的应用。 名词解释 等电点（pI） 肽键和肽链 肽平面及二面角 一级结构 二级结构 三级结构 四级结构 超二级结构 结构域 蛋白质变性与复性 分子病 肽 相同:虽然二者在组成上差异很大,但在构成方式上却很相似,主要表现在①都是由基本结构单位通过特定的共价键连接而成的大分子，②各自的主链都是不变成分，可变成分在侧链上。 相异： 比较项目 蛋白质 核酸 基本结构单位 20种氨基酸 4种（脱氧）核苷酸 连接的键 肽键 3ˊ，5ˊ-磷酸二酯键 主链的组成 由 -N-C?-CO- 由戊糖+磷酸 （不变成分） 反复循环组成 反复循环组成 侧链 20种AA残基的 核苷酸的4种 （可变成分） R侧链排列组合 碱基排列组合 基本结构单位通式 H2N-CH-COOH R H2PO3-O-H2C (O)H HO N 1、试比较核酸、蛋白质一级结构的异同，写出各自基本结构单位的通式 生物的遗传信息储存于DNA的核苷酸序列中，蛋白质的一级结构是由相应的DNA序列决定的，每一种蛋白质分子所具有的特定的一级结构又决定了其高级结构和生物学功能，也就表现出特定的生命现象。因此，研究核酸、蛋白质的一级结构可破译生命的密码，是在分子水平认识生命的突破口。 * (2) 结构域（structure domain） 蛋白质中相邻的二级结构单位（即单个α－螺旋或β－折叠或β－转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能辩认的二级结构组合体称为蛋白质的超二级结构 基本组合方式：αα；ββ；βαβ;βββ 在二级结构或超二级结构的基础上，多肽进一步卷曲折叠成几个相对独立、近似球形的三维实体，再由两个或两个以上这样的三维实体缔合成三级结构，这种相对独立的三维实体称为结构域。（具部分生物功能） 形成意义：?动力学上更为合理 ?蛋白质（酶）活性部位往往位于结构域之间，使其更具柔性 (１)超二级结构（ supersecondary structure ） βββ αα β×β 1 2 3 4 5 5 2 3 4 1 Β-链 βαβ β -迂回 回形拓扑结构 回形拓扑结构 β -迂回 ?-螺旋 ?-转角 ?-折叠 二硫键 结构域1 结构域2 功能域是蛋白质分子能独立存在的功能单位。结构域间的松散区形成空穴的部位常常就是功能域部位 丙酮酸激酶结构域4 羧肽酶 腺苷酸激酶 (a) (b) 丙糖磷酸异构酶 乳酸脱氢酶结构域1 黄素蛋白 多肽键在二级结构的基础上，通过侧链基团的相互作用进一步卷曲折叠，形成一个紧密的挖球状的结构。三级结构的形成使肽链中所有的原子都达到空间上的重新排布。 维持三级结构的力：盐键 、氢键、疏水键、范得华力、二硫键 实例：肌红蛋白 核糖核酸酶 153AA和1个血红素辅基 主要α螺旋、非规则构象 His93HisF8配位键 N His12 C His119 Lys41 124AA残基3个α螺旋5个β折叠 四级结构是指由相同或不同的称作亚基（subunit）的亚单位按照一定排布方式聚合而成的蛋白质结构，维持四级结构稳定的作用力是疏水键、离子键、氢键、范得华力。亚基本身都具有球状三级结构，一般只包含一条多肽链，也有的由二条或二条以上由二硫键连接的肽链组成。 实例：血红蛋白 烟草花叶病毒的外壳蛋白四级结构 2条α每条1412条β每条146 多肽链 蛋白质复杂的组成和结构是其多种多样生物学功能的基础；而蛋白质独特的性质和功能则是其结构的反映。蛋白质一级结构包含了其分子的所有信息，并决定其高级结构，高级结构和其功能密切相关。 生物 与人不同的AA数目 黑猩猩 0 恒河猴 1 兔 9 袋鼠 10 牛、猪、羊、狗 11 马 12 鸡、火鸡 13 响尾蛇 14 海龟 15 金枪鱼 21 角饺 23 小蝇 25 蛾 31 小麦 35 粗早链孢霉 43 酵母 44 14 10 6 100 1 34 32 30 29 27 18 17 67 59 52 51 48 45 41 38 87 84 82 80 70 68 91 Gly Gly Phe Cys Gly Gly Gly Arg Lys Gly Cys Lys Phe His Pro Leu Gly Arg Tyr Ala Asn Trp Tyr 70 75 80 Lys Lys Lys Pro Pro Tyr Ile Gly Thr Met Asn Leu 血红素 细胞色素c分子的空间结构 不变的AA残基 35个不变的AA残基，是Cyt C 的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与“识别”并结合细胞色素还原酶和氧化酶。 镰刀形红细胞 正常红细胞 ?-链N端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys… Hb-S（患 者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys… 正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图 1、胰岛素 胰岛素由二条链（A链21、B链30） 51个氨基酸残基组成。 前胰岛素原→胰岛素原→胰岛素 血红素 O2 Hb Hb- O2 O2 血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线 活动肌肉毛细血管中的PO2 0 20 40 60 80 100 肺泡中的PO2 Myoglobin Hemoglobin HbH+ + O2 HbO2 + H+ 增加氢离子浓度反应向左移动，即降低血红蛋白与氧的亲和力 血红蛋白与二氧化碳的结合位点与氧不同，氧合血红蛋白也能与二氧化碳结合。 Hb-NH2 + CO2 Hb-NHCOO- + H+ Hb-NHCOO-能与带正电荷的基团形成盐键，使脱氧血红蛋白构象稳定，从而降低血红蛋白对氧的亲和力。 血红蛋白的主要功能是运输氧。此外还能运输二氧化碳和调节血液的pH值。 2,3－二磷酸甘油酸与脱氧血红蛋白结合，使脱氧血红蛋白分子结构更加稳定，处于不易与氧结合的状态。 一、肽 二、两性解离性质及等电点 三、 蛋白质胶体性质 四、 蛋白质的沉淀 五、 蛋白质的变性与复性 六、 蛋白质的紫外吸收特性 七、 蛋白质呈色反应 谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。 一、肽 pH = pI 净电荷=0 pH pI 净电荷为正 pH pI 净电荷为负 Pr COOH NH3+ + H+ + OH- + H+ + OH- Pr COO- NH2 Pr COO- NH3+ 当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点 （isoelectric point，pI）。 蛋白质处在等电点时，其导电率、渗透压、粘度以及溶解度都是最低值 由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征。可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层水化层，同时这些颗粒带有电荷，因而蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体。 如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。 沉淀方法类别: 1、高浓度中性盐（盐析、盐溶） 在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵、氯化钠等中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层。同时又中和了蛋白质表面的电荷，从而使蛋白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为盐析（salting out） 特点：不变性 低浓度的硫酸铵等中性盐，可使蛋白质溶解度增加，这种现象称为盐溶（salting in） *